使蛋白质溶液在低离子强度下长出单晶,然后加

来源:http://www.kedun-detective.com 作者:生命科学 人气:163 发布时间:2019-08-27
摘要:核心提示:一、微量凯氏定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱 核心提示:传统方法难以对蛋白质进行分离且保持其活性,但采

核心提示:一、微量凯氏定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱

核心提示:传统方法难以对蛋白质进行分离且保持其活性,但采用连在磁珠上的单克隆抗体进行免疫沉淀富集,SDS-PAGE电泳法检测则可达想要结果传统方法难以对蛋白质进行分离且保持其活性,但采用连在磁珠上的单克隆抗体进行免疫沉淀富集,SDS-PAGE电泳法检测则可达想要结果。用磁珠分离细胞溶菌液中的蛋白质,几乎不需要预先处理,与其他方法相比,非特异性结合也较少。

核心提示:大量养晶法(bulkcrystallization):若急着养出单晶,则将纯化之蛋白质溶液加入固体盐类或饱和盐液,直到溶液中出现大量养晶法(bulkcrystallization):若急着养出单晶,则将纯化之蛋白质溶液加入固体盐类或饱和盐液,直到溶液中出现乳白混浊色,离心后把上清液(suppernatant)放置数天至数周,有可能养出单晶。 批次养晶法(batchmethod):若发现加入蛋白质的沉淀剂和盐类等化学药品,在浓度c1产生沉淀,浓度cn为液体,则在c1至cn之间细分成一串浓度c1>c2>c3>….>ci>cn,个小试管进行养晶,可能结出单晶。此法之主要缺点在于蛋白质的消耗量大。 大量透析法(bulkdialysis):把蛋白质溶液包在半透膜内,浸入盛有化学药品的器皿中,半透膜能让小分子进出,却不会让蛋白质等大分子通过,则器皿中沉淀剂、盐类和有机溶液等化学药品会穿过半透膜,与蛋白质起作用,直到膜之内外的浓度梯度(concentrationgradient)降到零为止。此法的好处在于,器皿中化学药品之浓度可作连续之调整,ph值的范围也可探讨。坏处是膜之内外浓度差异减少时,平衡速率也随之降低。微量透析法(microdialysis):把半透膜的体积缩小,绑在比钮扣略大的衬架上,架体之凹槽内注入蛋白质溶液,包覆半透膜的体架放入盛有化学药品的器皿,其养晶原理与大量透析法相同,只是使用蛋白质和化学药品的量放得少。注意凹槽内不得留有气泡,否则膜外的化学药品为气泡所阻止而无法透过气泡,渗入膜内的蛋白质溶液。 连续萃取(sequentialextraction):此法所根据的原理是亚可比的实验,他发现蛋白质在硫酸铵溶液中溶解度随温度的提升而下降。在4℃以下取得上清液(supernatant),放在室温长晶。先将蛋白质溶液加入固体硫酸铵或饱和硫酸铵液体,使蛋白质溶液沉淀,离心除去上清液。接着保持4℃以下处理一系列的蛋白质沉淀物。准备数种依次递降浓度的沉淀剂,浓度高的沉淀剂先加入上述蛋白质沉淀物中,以玻棒搅拌并离心,取出上清液,放在室温养晶,再把浓度次高的沉淀剂加入上次未完全溶解的蛋白质沉淀物,搅拌离心,把上清液置于室温养晶,依次类推,直到蛋白质全部溶解为止。这样每次取出的蛋白质浓度依次递减,溶液由低温移至高温,符合亚可比的准则,可能养出蛋白质单晶。 自由接口间的扩散法(freeinterfacediffusion):若蛋白质在不同的溶剂中具有不同的溶解度,则蛋白质注入盛有沉淀剂试管的上方或下方(依密度而定,密度大者放在下方),在两种溶液的交界面扩散会有晶核长出。 凹盘或玻片上的蒸汽扩散法(vapordiffusiononplatesorslides)―座滴法:蛋白质养晶的要领在于蛋白质达成过饱和溶液,同时添加的化学药物与蛋白质起作用,协助晶核的形成。掺有化学药品的蛋白质溶液,其水分慢慢扩散,达到过饱和溶液则有可能长出单晶。若蛋白质溶液暴露在空气中,水分蒸发掉,则蛋白质干涸,无法形成单晶,原因是蛋白质单晶约略维持液态的结构,含有大量水分,水分与蛋白质间形成许多氢键,水分蒸发,蛋白质也无以为系,因此必须保持水分,使蛋白质溶液密闭在一个容器中。同时还得调节水分,所以必须置放两种溶液,使蛋白质溶液中的水分扩散到另一种高浓度的溶液中,以达蛋白质溶液的过饱和。通常选择适当的盐类和有机溶剂,调在等电点的ph值,形成沉淀剂,把粉晶蛋白质泡成一定浓度,约在5~40mg/ml之间,在凹盘的下凹孔镀硅,注入一些蛋白质溶液和沉淀剂总共10~40ml。在凹盘外方的塑料盒,倒入20~30ml的沉淀剂。在塑料的四周涂真空油膏(vacuumgrease),加以密封。通常这样的塑料盒对于每种养晶条件制备两盒,一盒放在4℃的低温,另盒放在室温,待其长晶,快则一周,慢则数月,幸运的话,可望长出单晶。通常一次制备数拾条件,大量养晶。要鉴定长出的单晶确实是蛋白质而不是滴入的沉淀剂等化学药品。若养出蛋白质单晶太小,不足以供x光绕射实验使用,则可使用连续播种法把小晶粒养大:依照养出蛋白质小单晶的条件,炮制母液(蛋白质溶液配合沉淀剂),注入凹孔,外围倒注沉淀剂,加以密封,等待约半天后,打开封盖,把以前所养的小晶粒稍加清洗后放入,企图长大,若长出的晶体仍然不符x光使用,则把最后一次的晶体当新晶种,再继续播种,直到晶体够大。此种养晶法的好处是:用量少,筛选多种条件相当理想;易于修饰塑料盒内沉淀剂的浓度。此种养晶法装置,也可用具有凹槽的玻片来取代,在其一凹孔注入10ml的母液,另一凹孔注入20~40ml的沉淀剂,以小玻片密封,等待长晶。 悬滴液蒸汽扩散法(vapordiffusioninhangingdrops)―悬滴法:它在原理上和座滴法相同,皆以蒸汽达到平衡,利用少量蛋白质筛选多种养晶条件。此法用量比座滴液更少。在方形或圆形的玻片上镀硅,滴入少于10ml的蛋白质母液,在培养皿的每一凹槽中注入1ml的沉淀剂,把方形玻片翻转,盖在凹槽孔缘,加以密封,形成悬滴液,进行扩散,蛋白质溶液达到过饱和,长出单晶。 液体桥连法(liquidbridge):一小滴母液和一滴沉淀液分别滴在玻璃片的两靠近处,以细针引导细桥相接,把此载有液滴的玻片放在密封容器中,在细桥相连处可望长出单晶。浓度透析法(concentrationdialysis):离子强度弱,则蛋白质溶解度低,易形成晶核,长出单晶,可利用氮气在装有蛋白质和盐类的透析袋内施压,使盐类穿透透析膜流出,降低袋内盐类浓度,使蛋白质溶液在低离子强度下长出单晶。 ph引导长晶法:蛋白质的溶解度在等电点的ph值最低,是个良好的养晶条件。有些蛋白质在不同的数个ph值,具有数个溶解度的极小,这些溶解度极小处可望长晶。利用透析法改变透析膜外的ph值是个好办法。也可在蒸汽扩散法中,在外围滴入挥发性酸或碱来调节ph值。 温度长晶法(temperaturecrystallization):蛋白质溶解度为温度的函数,有些溶解度非常温度敏感。通常温度降低,分子排列较有秩序,引起能趋疲的降低。由液体转变到固体,其熵会降低,反之亦然。井然有序排列的分子易于长晶。通常一种长晶条件泡两份,一份置于室温,另一份放在4℃的冰箱。 蒸发(evaporation):这是最原始的方法,为小分子的长晶常用法,也是某些蛋白质常用的养晶法。在蛋白质不变性的条件下,慢慢让母液蒸发,使蛋白质溶液达到过饱和,结出单晶。 填加有效分子法(effectoraddition):与有效分子结合的蛋白质,其溶解度往往与无有效分子结合者差异大,可达到某些构象(conformation)平衡状态的存在,养出此种构象单晶,通常的有效分子有配位体和基质等。 对蒸馏水透析法(dialysisagainstwater):离子强度弱则蛋白质溶解度低,以半透膜装母液,外浸蒸馏水,盐类往膜外透出,待膜内蛋白质溶解度降低,可望长出单晶。此法相当有效,值得首次尝试。前提是蛋白质不得变性,有时添加少许<0.02%>的sodiumazide,或数滴甲苯或氯仿(chloroform)有助防止细菌的滋长。

核心提示:经过抗体测定的阳性孔,可以扩大培养,进行克隆,以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个

一、微量凯氏定氮法

要从全血,培养上清液,血清,腹水中分离蛋白质,用于制备、分析,运用磁珠作为固相载体进行免疫测定的优点在于快速的结合动力学和简单的分离,洗涤过程。在蛋白质纯化中,为了得到高结合容量需使用大孔如粒径为3.5um,并用链霉亲和素修饰的磁珠,生物素修饰的免疫球蛋白可顺利结合到磁珠上。键合配基的活性不会因孔结构而改变。

经过抗体测定的阳性孔,可以扩大培养,进行克隆,以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长,互相争夺营养和空间,而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早,太早细胞性状不稳定,数量少也易丢失。

样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨,氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下: nh2ch2cooh 3h2so4――2co2 3so2 4h2o nh3 2nh3 h2so4――2so4 2so4 2naoh――2h2o na2so4 2nh3 、在凯氏瓶内完成,反应在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化,可以加入cuso4作催化剂,k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量,如欲求得 样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。

金属鳌合磁珠亲和纯化是一种纯化重组蛋白的方法。在磁珠表面共价键合Nitrilotriacetic acid,加入Ni2 形成鳌合亲和磁珠纯化组氨酸标记的多肽。利用低浓度咪唑可将鳌合的肽洗脱。这种磁性鳌合载体为含量稀少,疏水,不稳定的重组蛋白和多肽纯化提供了新的思路。

克隆化的阳性杂交瘤细胞,经过一段时期培养之后,也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失,使部分细胞丧失产生抗体的能力,所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说,免疫性强的抗原克隆次数可少一些,但至少要3~5次克隆才能稳定。

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