最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染,3、

来源:http://www.kedun-detective.com 作者:生命科学 人气:60 发布时间:2019-08-27
摘要:核心提示:在真核细胞中表达蛋白的步骤比大肠杆菌复杂得多。首先要考虑选用什么载体。一般人们趋向于使用分 核心提示:Q: Does the PCR reaction volume influence the outcome?A: No,especially sin

核心提示:在真核细胞中表达蛋白的步骤比大肠杆菌复杂得多。首先要考虑选用什么载体。一般人们趋向于使用分

核心提示:Q: Does the PCR reaction volume influence the outcome?A: No, especially since the introduction of the

核心提示:PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生.污染PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生.污染原因 标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染. PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染. PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR产物拷贝量大,远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物污染,就可造成假阳就可形成假阳性. 还有一种容易忽视,最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题. 实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室,这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大.污染的监测 一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以 便采取措施,防止和消除污染.对照试验 1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照,它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性 对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳 性对照,其含量宜低不宜高.但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳 性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳 定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照. 2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是血清就用 鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.②试剂 对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增,以监测试剂是否污染. 3.重复性试验 4.选择不同区域的引物进行PCR扩增防止污染的方法一. 污染的预防进行PCR操作时,操作人员应该严格遵守一些操作规程,最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。划分操作区:目前,普通PCR尚不能做到单人单管,实现完全闭管操作,但无论是否能够达到单人单管,均要求实验操作在三个不同的区域内进行,PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行:1. 标本处理区,包括扩增摸板的制备;2. PCR扩增区,包括反应液的配制和PCR扩增;3. 产物分析区,凝胶电泳分析,产物拍照及重组克隆的制备。各工作区要有一定的隔离,操作器材专用,要有一定的方向性。如:标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。切记:产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。分装试剂:PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中,不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA:1. PCR用水应为高压的双蒸水;2. 引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制;3. 引物和dNTP应分装储存,分装时应标明时间,以备发生污染时查找原因。实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一。因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意:1. 戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套;2. 使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;3. 避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;4. 操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度;5. 最后加入反应模板,加入后盖紧反应管;6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性;7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器,至少PCR操作过程中加样器应该专用,不能交叉使用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区;8. 重复实验,验证结果,慎下结论。二. 追踪污染源如果不慎发生污染情况,应从下面几条出发,逐一分析,排除污染。设立阴阳性对照:有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时,应选择扩增弱,且重复性好的样品,因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列,反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照,100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重,因为PCR敏感性极高,可以从其它方法(Sourthern 印迹或点杂交等)检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外,每次扩增均应包括PCR体系中各试剂的时机对照,即包括PCR反应所需的全部成分,而不加模板DNA,这对监测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果,就是某一种或数种试剂被污染了。此时,要全部更换一批新的试剂进行扩增,扩增时设立不同的反应管,每一管含有一种被检测试剂,在检出污染试剂后,应马上处理。环境污染:在排除试剂污染的可能性外,更换试剂后,若不久又发现试剂被污染了,如果预防措施比较严密,则考虑可能为环境污染。 环境污染中常见的污染源主要有:1. 模板提取时真空抽干装置;2. 凝胶电泳加样器;3. 电泳装置;4. 紫外分析仪;5. 切胶用刀或手术刀片;6. 离心机;7. 冰箱门把手,冷冻架,门把手或实验台面等;此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。1)用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源;2)0.1ml去离子水浸泡;3)取5ml做PCR实验;4)电泳检测结果。8. 气溶胶。如果经过上述追踪实验,仍不能查找到确切污染源,则污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的,此时就应该更换实验场所,若条件不允许,则重新设计新的引物。三.污染处理环境污染1. 稀酸处理法:对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡,使残余DNA脱嘌呤;2. 紫外照射法:紫外波长一般选择254/300nm,照射30min即可。需要注意的是,选择UV作为消除残留PCR产物污染时,要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布,UV照射仅对500bp以上长片段有效,对短片段效果不大。UV照射时,PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体,这些二聚体可使延伸终止,但并不是DNA链中所有嘧啶均能形成二聚体,且UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV波长,嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA链上,形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基,其他非二聚体的光照损伤(如环丁烷型嘧啶复合体,胸腺嘧啶乙二醇,DNA链间与链内的交联和DNA断裂等)均可终止Taq DNA聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点在DNA分子上随机分布,一个500bp片段的DNA分子链上将有32处损伤位点,那么,105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反,如果100bp的片段,每条链上仅有6处损伤,105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV照射有一定的片段长度限制的原因。反应液污染可采用下列方法之一处理:1. DNase I法:PCR混合液(未加模板和Taq聚合酶)加入0.5U DNase I,室温反应30 min后加热灭活,然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列;2. 内切酶法:选择识别4个碱基的内切酶(如Msp I和Taq I等),可同时选择几种,以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷,室温作用1h 后加热灭活进行PCR;3. 紫外照射法:未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射,注意事项与方法同上述UV照射法;4. g射线辐射法:1.5kGy的辐射可完全破坏0.1ng基因组DNA,2.0 kGy可破坏104拷贝的质粒分子,4.0 kGy仍不影响PCR,但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR,g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。尿嘧啶糖苷酶法由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好,而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右,因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。1. 原理:在PCR产物或引物中用dU 代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育,因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键,可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸,从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶,而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。2. dUTP法:用dUTP代替dTTP,使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前,用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活,因此不会影响含dU的新的PCR产物。3. dU引物法:合成引物时以dU 代dT,这样PCR产物中仅5�@端带dU。UNG处理后,引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段的扩增用dUTP法效率较用dTTP低,而用dU法就可克服这一缺点。dU引物最好将dU设计在3�@端或近�@端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。4. 优点:可以去除任何来源的污染;UNG处理可以和PCR扩增在同一个反应管内进行;由于扩增产物中有大量dU存在,可彻底消除污染源。5. 需注意的是掺入dUTP的DNA不应对产物的任何操作有影响,在进行PCR产物克隆时,应该转化UNG-大肠杆菌受体菌,否则转化产物会被受体菌UNG消化掉。 固相捕获法用于去除标本中污染的核酸和杂质,原理如下:1)用一生物素标记的单链RNA探针与待扩核酸杂交,杂交区域是非扩增区;2)用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸,通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质;3)洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA探针杂交区域。第2)步的漂洗后可用PCR检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。RS-PCR法(RNA-specific PCR)也称为链特异性PCR,主要指用于RNA模板的特异性PCR法,该法可明显降低假阳性而不影响PCR的敏感性。其关键在于设计引物,逆转录引物的3�@端有2 0个核苷酸左右为模板的特异性互不序列,5�@端2 0个核苷酸为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后,经超速离心使 cDNA与多余引物分开,再用和第二引物以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA,以后的PCR循环中用逆转录引物的B区和引物C进行扩增加尾cDNA,而污染的DNA或质粒DNA才不会被扩增。抗污染引物法该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中,在重组质粒中,这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本,也不能扩增出任何条带,即使出现了扩增带,其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA才能被引物扩增,因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的,该法试用于环状靶分子系列。

核心提示:为了对以个特定序列进行PCR做重复检测,需要三个不同的区域,每一个区域的具体技术操作和试剂在下面详细列出. 1、样品准为了对以个特定序列进行PCR做重复检测,需要三个不同的区域,每一个区域的具体技术操作和试剂在下面详细列出. 1、样品准备区这个区域专门用作样品的准备,在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施:1)PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。2)组织培养物、组织标本和血清样品都带进样品准备间处理,以根据应用的需要提取DNA或RNA。3)用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具,也不能用作操作靶序列。4)DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作,以防止在吸取样品时有气溶胶遗留。5)大体积样品应该用单独包装的无菌一次性移液管吸取。6)管子打开前都要简短离心以减少气溶胶的产生,而且管子不能用力崩开,这样会产生气溶胶。7)任何时候都应该穿实验服和带手套,手套要经常更换,尤其在抽提过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间,经常清洗。2、样品准备和RNA-PCR RNA-PCR的额外步骤需要额外的样品操作,这样增加了样品之间污染的机会。为了避免这一问题,反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中应用UNG以防止污染的方法也有报道。3、前PCR区必须有专门用于准备各种反应的区域,这个区域必须保持干净,而且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR区必须要有试剂和准备,特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。4、PCR实验室试剂的操作1)所用的所有溶液都应该没有核酸和核酸酶(DNase和RNase)污染。2)所有PCR试剂中使用的水都应该是高质量的-新鲜蒸馏的去离子水,用0.22μm过滤的,并且是高压灭菌。3)在20℃到25℃贮存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂,在扩增试剂或样品制备试剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。4)所用试剂都应该以大体积配制,实验一下看试剂是否满意,然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。5)所有试剂和样品准备过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子。6)新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验。7)样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时都应该小心保存。5、在前PCR区建立PCR混合物1)可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃或4℃,在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。2)如果你的实验室使用多套引物,以致于配制包括所有试剂的单一反应混合物不够经济,可以考虑分装保存够一天的PCR成分。3)作为一个规则,应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品配制和PCR前过程的效率和洁净程度。而且,你也希望通过使用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里面不含扩增抑制物。4)阴性样品要与每组样品同时做,以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产物的污染,阴性对照应该包括核酸以外的所有试剂。5)当做阳性对照时,有两个理由决定了应该使用最少数量的核酸。6)由于必须有对照反应,对照模板的特点应该予以考虑。6、控制污染的方法已设计出很有力的酶学方法用来消除一种形式的污染―使用UNG,这一技术能有效地消除由PCR产物引起的污染。另一种控制污染的方法是使用紫外线,这种方法不能完全消除污染问题,但可以将污染降低几个数量级。7、PCR仪的位置8、后PCR区PCR完成以后,需要分析样品并解释数据,应该留出一个专门用于反应后处理样品的地方。后PCR活动中使用的所用试剂、一次性耗材和仪器都必须是专门用于这一目的,决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动。

在真核细胞中表达蛋白的步骤比大肠杆菌复杂得多。首先要考虑选用什么载体。一般人们趋向于使用分泌表达载体,以便于蛋白的纯化。但有的蛋白并不适合于分泌表达,如一些胞质蛋白,非糖基化蛋白等。此外分泌表达的蛋白信号肽存在一个效率问题。有的蛋白即使存在信号肽,也不能分泌。并且有的分泌蛋白较易受到蛋白酶的降解。所有这些因素都需综合考虑。

Q: Does the PCR reaction volume influence the outcome?

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