基本原理细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,

来源:http://www.kedun-detective.com 作者:生命科学 人气:87 发布时间:2019-08-27
摘要:核心提示:制片选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片,洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用 制片 选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片,洗净后浸泡于

核心提示:制片 选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片,洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用制片 选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片,洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。 固定 除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外,一般均应固定。固定的作用有三:①防止标本从玻片上脱落;②除去防碍抗原—抗体结合的类脂,使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果;③固定的标本易于保存,如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。 标本的固定原则是:①不能损伤细胞内的抗原;②不能凝集蛋白质;③不能损伤细胞形态;④固定后应保持细胞膜的通透性,以允许抗体进入与抗原结合。 水洗固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗,最后以蒸馏水冲洗,防止自发性荧光。染色染色分直接染色法与间接染色法。1. 材料与试剂荧光抗体,稀释至应用浓度。0.01Mol/L pH7.4PBS液9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。带盖方盘2.直接染色法将固定好的玻片置于湿盘中,滴加荧光抗体染色液,以覆盖为度,加盖,37℃感做30 min~45min。PBS冲洗3次,每次冲洗3min,即3×3�@冲洗。蒸馏水冲洗。滴甘油缓冲液一滴,封片,荧光显微镜检查。2. 间接染色法 检查抗原:①取固定标本,加已知的免疫血清,37℃孵育30min;②以PBS液3×3�@冲洗;③再加荧光标记的抗抗体,37℃孵育30min;④PBS 3×3�@冲洗;⑤H2O冲洗,凉干;⑥加甘油缓冲液,封片、镜检。检查抗体:①以免疫后动物的淋巴组织涂片,自然干燥,甲醇固定;②滴加相应抗原液(按1�s100~1�s500稀释),37℃孵育30min;③PBS液3×3�@冲洗;④加荧光抗体,37℃孵育30min;⑤PBS液3×3�@冲洗;⑥水洗,凉干;⑦加甘油缓冲液,封片、镜检。

核心提示:近些年来,随着一系列新仪器的研制成功和新方法的建立,免疫荧光技术也有很大的改进和发展。主要有荧光偏振分析技术、荧光激活细近些年来,随着一系列新仪器的研制成功和新方法的建立,免疫荧光技术也有很大的改进和发展。主要有荧光偏振分析技术、荧光激活细胞分类技术、利用稀土元素镧系铕做为标记物建立的时间分辨荧光技术以及均相荧光检测技术等。这里仅介绍荧光偏振免疫分析法的原理。该方法是利用荧光素经单一波长的偏振光照射后,能吸收光能并发射出相应的偏振荧光,其强弱程度与荧光分子的大小呈正相关。 荧光偏振免疫分析常用于测定半抗原的药物浓度。反应系统内除待测药物外,同时加入一定量用荧光素标记的相应药物,使二者与有限量的特异性抗体竞争结合。当待测药物浓度高时,经过竞争反应,大部分抗体被其结合,而荧光素标记的药物多呈游离的小分子状态。由于其分子小,在液相中转动速度较快,测量到的荧光偏振程度也较低。反之,如果药物浓度低时,大部分荧光素标记药物与抗体结合,形成大分子的抗原抗体复合物,此时检测到的荧光偏振程度也较高。根据荧光偏振程度与药物浓度呈反比关系,我们可以建立座标系。通过检测反应系中偏振光的大小,从坐标曲线上就可以精确地得知样品中待测药物的相应含量。

核心提示:基本原理 经固定的凋亡细胞其染色体荧光染料的DNA可染性性下降。细胞一经固定就不再是活细胞,而且细胞固定过程对细胞膜的通基本原理 经固定的凋亡细胞其染色体荧光染料的DNA可染性性下降。细胞一经固定就不再是活细胞,而且细胞固定过程对细胞膜的通透性也有影响。因此发展了用“细胞活性”鉴定染料染色的流式细胞仪检测方法。这些方法细胞不经固定就直接用DNA染料染色,且染料的浓度要比固定细胞所用的浓度要低得多。流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”,因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。活细胞染料如Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高,Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜通透性发生改变有关,凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变,但细胞膜的通透性已有增强,因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多。此外,还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。既然Hoechst 33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易,而EB、PI或7-AAD等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中,即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染,坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损,可被这些染料染色。根据这些特性,用Hoechst 33342结合PI或EB等染料对凋亡细胞进行双染色,就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上,这三群细胞表现分别为:正常细胞为低蓝色/低红色(Hoechst 33342 /PI ),凋亡细胞为高蓝色/低红色(Hoechst 33342 /PI ),坏死细胞为低蓝色/高红色(Hoechst 33342 /PI )。试剂与仪器 Heochst 33342 染液:用PBS配成10ug/ml的储存液浓度,4℃避光保存; PI染液 :用PBS配成5ug/ml浓度,4℃避光保存。 400目的筛网 流式细胞仪实验步骤1. 悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst 33342 ,终浓度为1ug/ml; 37℃孵育7—10min。2. 低温500 ~ 1000r/min离心5min弃去染液。3. 加入1.0ml PI染液,4℃避光染色15min。4. 400目的筛网过滤1次。5. 流式细胞仪分析:Heochst 33342用氪激光激发的紫外线荧光,激发光波波长为352nm,发射光波波长为400 ~ 500nm,产生兰色荧光;PI用氩离子激光激发荧光,激发光波波长为488nm,发射光波波长大于630nm,产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。6. 结果判断:在兰色荧光对红色荧光的散点图上,结果为:正常细胞为低蓝光/低红光,凋亡细胞为高蓝光/低红光,坏死细胞为低蓝光/高红光。注意事项1. 在红色荧光对兰色荧光散点图上,还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹,可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。2. 用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长,一般控制在20min之内为宜。如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移,导致红色荧光与兰色荧光的比例改变,从而影响结果的判断。

核心提示:基本原理细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸从细胞膜内转基本原理细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸从细胞膜内转移到细胞膜外,使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca 依赖的磷脂结合蛋白,最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白,Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此,可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。试剂与仪器 孵育缓冲液:10mmol/L HEPES/NaOH,PH 7.4,140mmol/L NaCl,5mmol/L CaCl2 标记液:将FITC- Annexin V和PI加入到孵育缓冲液中,终浓度均为1ug/ml 流式细胞仪实验步骤1. 细胞收集:悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中,每样本细胞数为×106,/mL 500~1000r/min离心5min,弃去培养液。2. 用孵育缓冲液洗涤1次,500~1000r/min离心5min。3. 用100ul的标记溶液重悬细胞,室温下避光孵育10~15min。4. 500~1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。5. 加入荧光溶液4℃下孵育20min,避光并不时振动。6. 流式细胞仪分析:流式细胞仪激发光波长用488nm,用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光,另一波长大于560nm的滤器检测PI。7. 结果判断:凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性,坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光,而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此,在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为(FITC-/PI-);右上象限是非活细胞,即坏死细胞,为(FITC /PI );而右下象限为凋亡细胞,显现(FITC /PI-)。

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